LC液相色譜儀是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于20世紀60年代后期引入了LC液相色譜儀理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。與經(jīng)典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻。因為較小的填充顆粒具有高柱效，但會(huì )引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜。
使用LC液相色譜儀時(shí)，液體待檢測物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開(kāi)色譜柱，通過(guò)檢測器得到不同的峰信號，zui后通過(guò)分析比對這些信號來(lái)判斷待測物所含有的物質(zhì)。LC液相色譜儀作為一種重要的分析方法，廣泛地應用于化學(xué)和生化分析中。液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。
LC液相色譜儀的構造
液相色譜系統主要由流動(dòng)相儲液瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄儀組成，其整體組成類(lèi)似于氣相色譜，但是針對其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調整。液相色譜的輸液泵要求輸液量恒定平穩，進(jìn)樣系統要求進(jìn)樣便利、切換嚴密。同時(shí)，由于液體流動(dòng)相黏度遠遠高于氣體，為了減低柱壓，液相色譜的色譜柱一般比較粗，長(cháng)度也遠小于氣相色譜柱。
LC液相色譜儀它包括空柱和填料?？罩莾缺趻伖獾牟讳P鋼管，內徑為4～5mm，長(cháng)100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機械往復泵輸入新鮮脫氣的流動(dòng)相。
等基線(xiàn)平直后可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷（含 0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）為流動(dòng)相測定柱效及分離度塔板數在2～3萬(wàn)/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個(gè) 50mm長(cháng)，4~5mm內徑，裝有硅膠（40-50mm）或立柱相同填料的保護柱（預柱）接在主柱之前，以延長(cháng)色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng)，以洗去鹽類(lèi)、酸堿等雜質(zhì)防止柱生銹及填料中雜質(zhì)的積聚，再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。
流動(dòng)相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動(dòng)相放于貯液瓶中，經(jīng)過(guò)有濾過(guò)頭、內徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱，zui后自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動(dòng)相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法，即自洗脫開(kāi)始到結束，溶劑的配比恒定。
另一類(lèi)為梯度洗脫法，即使溶劑的極性強度在色譜過(guò)程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，從而使同一個(gè)試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的都能在一次色譜過(guò)程中很好分離，而整個(gè)色譜過(guò)程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學(xué)檢測的反相液相色譜法中。
LC液相色譜儀是一類(lèi)分離與分析技術(shù)，其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中。為了區分各種方法，根據固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
LC液相色譜儀的使用和維護注意事項：
?、俦苊鈮毫蜏囟鹊募眲∽兓叭魏螜C械震動(dòng)。柱壓的突然升高或降低也會(huì )沖動(dòng)柱內填料，因此在調節流速時(shí)應該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉動(dòng)不能過(guò)緩。
?、趹饾u改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/div>
?、垡话阏f(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì )迅速降低柱效。
?、苓x擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。
?、荼苊鈱碗s的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進(jìn)行預處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護柱。
?、藿?jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質(zhì)。
?、弑４嫔V柱時(shí)應將柱內充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置至次日或更長(cháng)時(shí)間。
?、嗌V柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是濾片被堵塞，這時(shí)應更換濾片或將其取出進(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。
?、嵋怨枘z為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內使用。每次分析檢測完成后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線(xiàn)平衡。
對LC液相色譜儀的要求
1、流動(dòng)相必須用HPLC級的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)（使用0.45μm或更細的膜過(guò)濾）。
2、流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。
3、不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì )使單向閥粘住而導致泵不進(jìn)液。
4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
5、長(cháng)時(shí)間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相（如，甲醇等），因為，純水易長(cháng)霉。
6、每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器。
7、C18柱不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。
8、堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過(guò)濾器→管路過(guò)濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：
?、僖援惐甲魅軇_洗；
?、诜旁诋惐贾虚g用超聲波清洗；
?、塾?0％稀硝酸清洗；
9、氣泡會(huì )致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
10、如果進(jìn)液管內不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。
11、要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。
12、LC液相色譜儀更換流動(dòng)相時(shí)應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下。
