高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1.液固色譜法：使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構體。
2.液液色譜法：使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學(xué)鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。
涂布式固定相應具有良好的惰性;流動(dòng)相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失;溫度的變化和不同批號流動(dòng)相的區別常引起柱子的變化;另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少采用?，F在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、 C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法： 采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動(dòng)相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷)，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等)。
反相色譜法：一般用非極性固定相(如C18、C8);流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用為廣泛，據統計，它占整個(gè)HPLC應用的80%左右。
隨著(zhù)柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用于某些無(wú)機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8)，太高的pH值會(huì )使硅膠溶解，太低的pH值會(huì )使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。
3.離子交換色譜法： 固定相是離子交換樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱(chēng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂)或季氨基(陰離子交換樹(shù)脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹(shù)脂上的離子交換基團作用強弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.離子對色譜法：又稱(chēng)偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。 離子對色譜法常用ODS柱(即C18)，流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進(jìn)行分離。被測組分保時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強度有關(guān)。
5.排阻色譜法：固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間長(cháng);大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。
